4.1. Laboratório de Microbiologia

Observaão microscópica de bactérias - coloração de Gram

A observação de microrganismos reveste-se de dificuldades nãão só devido à sua reduzida dimensão mas, também, porque estes são transparentes e praticamente incolores. Com o propósito de estudar as suas propriedades e/ou de diferenciar os microrganismos em grupos específicos para fins taxonómicos e de diagnóstico, recorre-se normalmente a técnicas de coloração. A coloração de Gram, desenvolvida em 1884 pelo médico dinamarquês Christian Gram,é um dos métodos de coloração mais aplicados em Bacteriologia. Trata-se de um método de coloração diferencial, dado que permite dividir as bactérias em duas classes - Gram negativas e Gram positivas. É pois uma ferramenta essencial na classificação e diferenciação de bactérias. Esta diferenciação baseia-se na diferente estrutura e composição, nomeadamente no diferente teor lipídico, da parede celular de bactérias Gram positivas e Gram negativas. A parede celular das bactérias Gram negativas tem um teor em lípidos elevado na sua membrana externa, para além de uma camada fina de peptidoglicano que circunda a membrana plasmática. Em consequência, durante o passo de diferenciação pelo alcool, parte dos lípidos são dissolvidas pelo alcool, formando-se poros na parede por onde o corante primário (violeta de cristal) sai das células. Estas células ficam transparentes após o passo de diferenciação pelo álcool, sendo posteriormente coradas com o corante secundário (safranina). A parede celular das bactérias Gram positivas é constituída principalmente por uma camada grossa de peptidoglicano e o seu teor em lípidosé nulo ou muito baixo (em poucas espécies bacterianas). A camada de peptidoglicano actua, assim, como uma barreira impedindo a saída do corante primário e estas células ficam coradas de violeta escuro.

Proposta de trabalho experimental

I1

Coloração de Gram e observação microscópica das células de bactérias presentes num iogurte (cultura mista das bactérias Lactobacillus bulgaricus eStreptococcus thermophilus) e nas culturas puras das espécies Escherichia coli eBacillus subtilis fornecidas em meio LB sólido (contido em placa de Petri).

    Coloração de Gram de bactérias das espécies Escherichia coli eBacillus subtilis;
      Coloração de Gram de bactérias presentes num iogurte;
    Coloração de Gram de células de B. subtilis e de E. coli

    Procedimento experimental

    1. Preparar suspensões de células de E. coli e de B. subtilis em água destilada: transferir, com uma ansa esterilizada na chama do bico de Bunsen, uma porção de cada uma das culturas fornecidas, para tubos Eppendorf contendo 0.5 mL de água destilada. Agitar no vóórtex;

    I2

    2. Preparar um esfregaço de cada uma das culturas, espalhando uma gota de cada uma das suspensões celulares preparadas acima sobre uma lâmina de vidro desengordurada, recorrendo a uma ansa esterilizada. Secar ao ar;

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    3. Fixar cada esfregaço pelo calor, passando rapidamente a lâmina contendo o esfregaço sobre a chama do bico de Bunsen. Repetir este procedimento mais duas vezes;

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    4. Corar a preparação pelo método de Gram;

    5. Observar no microscópio óptico de campo claro com objectiva de imersão (x 100), não esquecendo colocar uma gota de óleo de imersão entre a preparação e a objectiva.

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    Coloração de Gram das bactérias do iogurte

    Procedimento experimental

    1. Homogenizar o iogurte com uma vareta;

    2. Preparar um esfregaço, espalhando uma gota de iogurte homogeneizado sobre uma lâmina de vidro previamente desengordurada com xilol. Secar ao ar;

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    3. Desengordurar o esfregaço, cobrindo-o com xilol durante 1 minuto. Secar ao ar;

    4. Fixar o esfregaço desengordurado, cobrindo-o comálcool etílico a 95% (v/v), durante 5 minutos. Secar ao ar;

    I7

    5. Corar a preparação pelo método de Gram;

    6. Observar no microscópio óptico de campo claro, com a objectiva de imersão (x 100), não esquecendo colocar uma gota de óleo de imersão entre a preparação e a objectiva.

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    Coloração de células pelo método de Gram

    Procedimento experimental

    1. Cobrir o esfregaço da cultura em estudo (previamente fixado à lâmina de vidro) com uma soluéo de violeta de cristal (VC). Deixar actuar durante 1 minuto.

    Nota:

    Após este passo, todas as células ficam coradas com o violeta de cristal (corante primário).

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    2. Escorrer o corante e lavar com água. Secar com papel de filtro, sem esfregar. Cobrir a preparação com reagente de Lugol e deixar actuar durante 1 minuto.

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    3. Escorrer a solução de Lugol, lavar com água e secar.

    Nota:

    O iodo da solução de Lugol forma um complexo insolúvel com o corante primário. O complexo violeta de cristal-iodo (VC-I) tem uma cor mais intensa (violeta escuro) do que o VC livre e é mais díficil de remover das células.

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    4. Diferenciar pelo álcool a 90°, deixando cair a solução de álcool gota a gota sobre a preparação até que não saia mais corante.

    Nota:

    Este é o passo de diferenciação entre bactérias Gram negativas e Gram positivas. As primeiras perdem o complexo VC-I e as últimas retêm-no. As células de bactérias Gram positivas ficam, pois, coradas de violeta-escuro e as Gram negativas ficam incolores.

    I12

    5. Lavar com água, escorrer e secar com papel de filtro.

    6. Tornar a corar a preparação, durante 5 minutos, com uma solução de safranina.

    Nota:

    As células incolores de bactérias Gram negativas ficam coradas de cor-de-rosa (cor do contra-corante safranina).

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    7. Escorrer o corante, lavar com água e secar com papel de filtro.

    I14 

     

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