3.1. Genómica Funcional e Fisiológica

Análise de expressão global

Análise da expressão proteómica

A obtenção da sequência de nucleótidos do genoma de um organismo constitui um primeiro passo que abre caminho à realização de muitos outros estudos. De facto, através da inspecção da sequência do genoma não é possível obter informação sobre o nível de expressão de genes, ou sobre características das proteínas expressas, tais como o seu o tempo de ½ vida, a sua localização sub-celular, eventuais modificações pós-tradução, interacções proteína-proteína e proteína-DNA, a estrutura e a função biológica das proteínas. Contudo, a sequenciação dos genomas de diversos organismos modelo, tornou praticável a análise da expressão genómica (todos os genes expressos a partir do genoma) que contrasta com a abordagem clássica, gene a gene. A análise da expressão global através do proteoma (todas as PROTEínas expressas do genOMA) permite revelar proteínas (ou os genes codificantes) envolvidas em processos dinâmicos que ocorrem após a perturbação de um dado estado fisiológico, através da comparação da sua concentração celular, antes e após essa perturbação. A monitorização do nível das proteínas, através de proteómica quantitativa (também conhecida por análise de expressão proteómica ou proteómica comparativa), permite apreciar o resultado da regulação da expressão genética que ocorre pós-transcrição e pós-tradução e pode fornecer numerosas pistas quanto à função biológica das diversas proteínas envolvidas e esclarecer qual o seu envolvimento nos processos biológicos examinados.

Numa das abordagens mais comuns em proteómica quantitativa, recorre-se à separação das proteínas presentes em amostras biológicas, por electroforese bi-dimensional (2-D) em géis de poliacrilamida. A esta separação segue-se a comparação do conteúdo de cada uma das proteínas, produzidas em células ou tecidos que se encontram em diferentes estados fisiológicos, utilizando software desenvolvido para o efeito. A identificação das proteínas cuja expressão sofreu uma alteração significativa permite obter pistas sobre o seu possível envolvimento no processo biológico em apreciação. A análise das modificações das proteínas que ocorrem pós-tradução é também muito importante porque estas podem determinar o seu tráfego, a sua funcionalidade e o seu nível de actividade, sendo pois crucial para a compreensão das complexas redes de regulação subjacentes às respostas celulares a qualquer perturbação ambiental.

A evolução da abordagem experimental da proteómica quantitativa tem resultado do desenvolvimento, integração e automatização de uma variedade de técnicas e equipamentos que permitem separar, identificar, quantificar e caracterizar proteínas, bem como relacionar essa informação com a obtida por outras abordagens, através da Bioinformática.

Proteómica quantitativa - abordagem experimental

Em proteómica quantitativa, uma das técnicas base mais utilizadas para a separação de proteínas é a electroforese a duas dimensões (2-D). Na electroforese2 , as proteínas em solução são separadas com base em duas das suas propriedades: numa primeira dimensão, de acordo com o seu ponto isoeléctrico (pI) e, numa segunda dimensão, em gel de SDS-PAGE, de acordo com o seu peso molecular (MW). Ou seja, a electroforese 2-D resulta da combinação de duas técnicas: a focagem isoeléctrica (IEF- Iso Electric Focusing), seguida de uma separação por SDS-PAGE. Quando bem sucedida, obtém-se um gel de poliacrilamida contendo numerosos spots, bem separados, cada um correspondendo a uma proteína (ou a uma forma proteica), como ilustrado na figura abaixo que permite comparar a separação obtida por SDS-PAGE (à esquerda) e por electroforese bi-dimensional (à direita).

Os fundamentos desta abordagem foram apresentados, pela primeira vez, por O’Farrell e Klose em 1975 (O'Farrell, 1975Klose, 1975). Desde então, têm-se verificado melhoramentos substanciais na qualidade e reproductibilidade dos resultados obtidos, em consequência do desenvolvimento de equipamentos e reagentes específicos. Hoje em dia, a aplicação da electroforese 2-D permite uma alta resolução das várias espécies proteicas presentes numa amostra biológica, de uma forma reproductível.

Para além da sua alta resolução e reproductibilidade, a electroforese 2-D permite também separar as várias formas proteicas que tenham sofrido modificações pós-tradução. A separação destas formas é possível visto que essas modificações conferem propriedades diferentes à proteína, em particular, um diferente ponto isoeléctrico ou peso molecular. Por exemplo, consegue-se distinguir as formas fosforilação e não-fosforilada das fosfo-proteínas porque este tipo de modificação pós-tradução implica uma alteração do seu pI e peso molecular. Pode-se avaliar a presença de proteínas fosforiladas num proteoma dividindo a amostra proteica em duas alíquotas, e tratando uma delas com uma fosfatase, para remoção dos grupos fosfato. Por comparação dos mapas obtidos após separação por electroforese bi-dimensional das amostras, tratada e não tratada, é possível identificar as proteínas que se encontram fosforiladas, uma vez que a perda do grupo fosfato resulta na sua migração para zonas mais básicas do gel, durante a focagem isoeléctrica (Yamagata et al., 2002). Modificações do tipo acetilação, glicosilação ou hidrólise específica de determinados péptidos, alteram o peso molecular da proteína modificada e, eventualmente, o seu pI, tornando assim possível a detecção dessas formas com base nos géis 2-D.

Em estudos de proteómica quantitativa, a análise comparativa dos proteomas obtidos em duas (ou mais) situações em estudo, tem por objectivo identificar e quantificar as possíveis alterações ao nível da abundância relativa de cada espécie proteica separada nos géis 2-D. Desta forma, torna-se possível identificar as proteínas envolvidas na resposta celular à alteração imposta. Geralmente, é construído um mapa de referência do proteoma de células cultivadas na condição de referência. Este mapa de referência é construído através da catalogação das várias espécies proteicas separadas em géis 2-D, após a sua identificação.

Em termos experimentais, os vários passos da análise global por proteómica quantitativa, utilizando a electroforese 2-D como técnica de separação, estão representados no esquema seguinte. Podemos ainda consultar o procedimento experimental.


(Adaptado de Santos PM et al., 2004)

Proteómica Quantitativa - Exemplos de aplicação à investigação em Microbiologia

A proteómica quantitativa, baseada na electroforese 2-D, tem-se revelado muito útil na obtenção de pistas que possam guiar a investigação dedicada a problemas biológicos que requeiram o estudo comparativo da expressão genética das células em diferentes situações ambientais. Em seguida, serão apresentados dois exemplos deste tipo de estudo. Os estudos aqui exemplificados tinham por objectivo a identificação de determinantes e de mecanismos de adaptação e resistência a um determinado stresse químico, em dois sistemas biológicos diferentes: a levedura Saccharomyces cerevisiae e a bactéria Pseudomonas putida, ambos organismos modelo, com a sequência completa do genoma disponível desde 1996 (Goffeau et al., 1996) e 2002 (Nelson et al., 2002), respectivamente.

Alteração do proteoma de P. putida em resposta a stress causado por fenol

Comparação do proteoma de P. putida durante a adaptação e crescimento sob stress causado pelo fenol

O recurso à análise proteómica quantitativa permitiu identificar aspectos da resposta global ao stresse causado pelo fenol na estirpe modelo Pseudomonas putida KT2440, que tem a sequência do genoma completamente determinada, o que tornou praticável a identificação, de uma forma relativamente expedita, de cerca de duas centenas de proteínas, separadas nos géis 2-D.

Quando se adicionou fenol a uma cultura dessa estirpe bacteriana em fase decrescimento exponencial verificou-se uma inibição do crescimento (para 600 mg/l de fenol) ou a paragem do crescimento, embora sem redução da viabilidade celular (para 800 mg/l de fenol) (ver figura). As amostras celulares recolhidas para comparação do proteoma corresponderam a três condições fisiológicas diferentes: i) células controlo (a dividirem exponencialmente na ausência de fenol) e células expostas durante 1 hora a duas concentrações de fenol: ii) 600 mg/l ou iii) 800 mg/l.

Numa primeira fase, foi construído um mapa de referência do proteoma de P. putida KT2440 (ver figura abaixo), cultivada no meio de crescimento base sem suplementação com fenol, através da identificação, por espectrometria de massa, de 195 proteínas separadas nos géis 2-D (material suplementar em Santos et al., 2004. Este número corresponde a cerca de 20% do total das proteínas detectadas em cada gel.

Conteúdo gentilmente cedido por: IST
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