Contagem de células totais

Método de contagem directa de células totais através da câmara de contagem Neubauer e recurso ao microscópio.

Este método baseia-se no preenchimento com uma suspensão de células a contar, de uma cavidade situada entre uma lâmina e uma lamela. Esta cavidade, localizada no centro da lâmina, encontra-se dividida em quadrados de dimensões bem definidas e, assim, de volume conhecido.

Utilizando o microscópio, é possível contar o número de células presentes em cada quadrado e, assim, conhecer o número de células por unidade de volume, como ilustrado na figura acima. A lâmina utilizada para este tipo de contagem é frequentemente designada por hemocitómetro, dado que tem origem nas câmaras inicialmente concebidas para contar células do sangue.

A contagem directa ao microscópio permite estimar fácil e rapidamente o número total de células numa população microbiana. Contudo, tem várias limitações, nomeadamente:

  • Não permite distinguir células viáveis de células mortas;
  • Células muito pequenas, como é o caso das células de muitas bactérias, são difíceis de distinguir;
  • É um método pouco preciso;
  • O fraco contraste entre as células transparentes e o meio circundante, quando a amostra não é corada, dificulta (ou inviabiliza) a contagem. Nestes casos, é necessário utilizar um microscópio de contraste de fase;
  • O método não é adequado para quantificar suspensões celulares pouco densas (por exemplo, no caso de suspensões bacterianas com menos de 106 células/mililitro);
  • Células móveis devem ser imobilizadas antes de se proceder à contagem.

Contagem de células viáveis

Contagem de Unidades Formadoras de Colónias (UFCs)

Na contagem directa ao microscópio referida anteriormente são contadas tanto células viáveis como células mortas. Em muitos casos estamos interessados somente na contagem do número de células viáveis. O modo usual de realizar uma contagem de células viáveis consiste em determinar o número de células capazes de formar colónias num meio de cultura sólido com composição adequada ao crescimento do microrganismo em causa. Assume-se que cada colónia é originada a partir de uma única célula viável, o que nem sempre é verdade (p. ex. duas ou mais células que formem um agregado, darão origem a uma única colónia). Por isso, os resultados são normalmente expressos em Unidades Formadoras de Colónias  (UFCs) e o método é vulgarmente designado por contagem de UFCs.

Procedimento geral para a contagem de UFCs numa suspensão celular, através do recurso à contagem de colónias isoladas por espalhamento, após sujeição da suspenção de células a diluições sucessivas.

Após diluição conveniente da suspensão celular em água ou em solução salina (0,9% (p/v) de NaCl) estéreis, espalha-se um volume conhecido (0,1 ml) de cada suspensão diluída sobre meio de cultura sólido com composição adequada para a multiplicação celular do microrganismo em causa contido numa caixa ou placa de Petri. Pretende-se que as células fiquem distanciadas de modo a que, após várias divisões celulares, originem colónias visíveis à vista desarmada (o que só se verifica após mais de um dia de incubação a temperatura óptima, por exemplo 30-35ºC para organismos mesófilos) e bem isoladas umas das outras. O grau de diluição da suspensão celular deve ser escolhido de modo a que o número de colónias isoladas em cada placa não seja inferior a 20 ou superior a 300 colónias.

Nota

Todo o material utilizado deve ser esterilizado previamente e todos os passos do procedimento devem ser realizados em condições de assépsia, ou seja, junto à chama do bico de Bunsen e/ou numa câmara de fluxo laminar.

Apesar dos erros experimentais associados à contagem do número de UFCs (p. ex. erros cometidos nas diluições ou associados ao deficiente arrefecimento do espalhador de vidro após esterilização pelo calor na chama do bico de Bunsen, ou ao deficiente isolamento das células presentes nas amostras diluídas), este método fornece uma informação muito importante sobre o número de células viáveis numa população. O método tem a virtude de ser bastante sensível, permitindo que suspensões celulares contendo muito poucas células possam ser quantificadas.

O uso de meios de cultura selectivos e condições de cultura específicas para incubação das placas de Petri inoculadas com as suspensões celulares, pode permitir o isolamento de colónias e, por conseguinte, a contagem de microrganismos diferentes numa população mista. É possível, assim, com base neste método, detectar uma contaminação microbiana em alimentos, amostras clínicas, amostras de água, etc.

Análise espectrofotométrica da Densidade Óptica (D.O.) de uma cultura microbiana

A avaliação da turbidez de uma cultura microbiana constitui um método rápido, embora indirecto, de estimar a concentração celular. Um feixe de luz focado numa suspensão microbiana é parcialmente desviado (dispersão da luz) pelas células, e a percentagem de luz não desviada (transmitância, T) é medida por recurso a um espectrofotómetro. A quantidade de luz que atravessa a suspensão celular depende da concentração de células na suspensão e do tamanho destas, do comprimento de onda e da intensidade(I0) da luz incidente e do diâmetro do tubo que contém a suspensão celular. A Densidade Óptica (D.O.) da cultura corresponde à Absorvância, que é determinada com base na expressão D.O = log ( I0/I )), onde I0 é a intensiade da luz incidente e é a intensidade da luz transmitida através da suspensão de células.

Comprimentos de onda frequentemente usados para medição da Densidade Óptica de suspensões de células de bactérias ou leveduras incluem 540, 600 ou 640 nm.

Representação do percurso efectuado pelo feixe de luz emitido pela fonte num espectrofotómetro (percurso óptico).

Representação do percurso efectuado pelo feixe de luz emitido pela fonte num espectrofotómetro (percurso óptico).

A fotocélula (detector) quantifica a luz que não foi desviada pelas células presentes na suspensão microbiana, I, medindo-se a Densidade Óptica (D.O) dessa suspensão (com base na Absorvância).

Para suspensões celulares muito concentradas deixa de haver uma relação linear entre a D.O. da cultura e o número de células na suspensão celular (gráfico à esquerda).

Fig. 1 - Para suspensões celulares muito concentradas deixa de haver uma relação linear entre a D.O. da cultura e o número de células na suspensão celular (gráfico à esquerda). Exemplo de duas curvas de crescimento reais, obtidas com base na medição da D.O. da suspensão celular ao longo do tempo, para dois microrganismos diferentes (gráfico à direita).

Existe, dentro de certos limites, uma relação linear entre a Absorvância ou  D.O. da cultura e o número total de células por mililitro de suspensão, ou seja a concentração celular. Contudo, para suspensões celulares muito densas (por exemplo com DO560 superior a 0,4) é frequentemente necessário diluir as culturas de modo a que todos os valores de D.O. medidos estejam incluídos na parte linear da curva D.O. versus concentração celular (ver gráfico do lado esquerdo).

Este método não permite distinguir entre células viáveis e células mortas e não permite obter directamente valores absolutos da concentração de células, sendo especialmente utilizado quando se pretende confirmar se uma dada cultura se encontra em crescimento ou para acompanhar o crescimento microbiano com base no aumento da D.O. medida a um comprimento de onda particular.

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